原代細(xì)胞培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)原理
是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。

原代細(xì)胞培養(yǎng)實驗內(nèi)容：
動物的選擇：
選擇大約一半足孕時間的胚胎，10－13天齡胚胎含有大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。
每組小鼠胚胎1個

實驗材料：
每組的超凈臺中有以下物品：
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25% 1瓶；PBS (-)1 瓶
2. 100ml滅菌燒杯2個；
3、50ml離心筒2個
4、滅菌培養(yǎng)皿1個，細(xì)胞培養(yǎng)瓶1個
4、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個
5、細(xì)胞計數(shù)板1塊；
6、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把；
7、酒精燈1臺；

試驗操作步驟：
1)胚胎的分離。適用哺乳動物(倉鼠、小鼠和大鼠)
a．采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動物。
b．立即在無菌超凈臺內(nèi)用70％乙醇擦洗整個動物。
c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。
d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。
e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。
f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

2)將1－2個胚胎轉(zhuǎn)移至一個小的無菌培養(yǎng)皿中，用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎， 用PBS漂洗。
3)在無菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一50ml 的無菌離心筒中, 加入40ml 0.25％的無菌,用攪拌棒輕輕攪動 。
4)在溫暖的環(huán)境中或置于37 °C培養(yǎng)箱中輕輕搖動15分鐘。
5)讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無菌50ml的離心管中，該管內(nèi)按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以滅活。

6)加人新鮮溶液(見前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的原來的50ml離心筒中，重復(fù)步驟4和5。
7)離心混合的細(xì)胞懸液，1200r/rain，5分鐘，棄上清。
8)用新鮮的無菌PBS重懸沉淀的細(xì)胞，按步驟7再次離心。
9)用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞直至上清清亮為止。