細(xì)胞凋亡檢測方法

　　細(xì)胞凋亡檢測是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的重要環(huán)節(jié)，用于確定細(xì)胞是否發(fā)生了程序性死亡。細(xì)胞凋亡是一種由基因決定的細(xì)胞自動(dòng)結(jié)束生命的過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等，與生物體的正常發(fā)育、免疫系統(tǒng)控制、老化細(xì)胞清除等密切相關(guān)。以下是細(xì)胞凋亡檢測的主要方法：
 

　　一、形態(tài)學(xué)檢測
 

　　光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡：
 

　　凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。
 

　　貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
 

　　常用姬姆薩染色、瑞氏染色等方法觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變，如染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀等。
 

　　電子顯微鏡：
 

　　透射電子顯微鏡觀察是判斷凋經(jīng)典、可靠的方法，被認(rèn)為是鑒定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。
 

　　凋亡細(xì)胞在電鏡下體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，晚期細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
 

　　二、基于生物學(xué)功能的方法
 

　　Annexin V/PI雙染色法：
 

　　Annexin V是一種對磷脂酰絲氨酸(PS)有高度親和力的Ca²?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，而PS在細(xì)胞凋亡早期會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)。
 

　　通過熒光標(biāo)記的Annexin V與PI聯(lián)合染色，可以區(qū)分正常細(xì)胞(Annexin V-/PI-)、早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)和晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞(Annexin V+/PI+)。
 

　　線粒體膜電位檢測：
 

　　細(xì)胞凋亡早期，線粒體膜通透性增加，膜電位下降甚至消失。
 

　　常用親脂性陽離子染料如JC-1，通過熒光顯微鏡觀察熒光的強(qiáng)弱來檢測線粒體膜電位的變化。
 

　　三、基于生化標(biāo)記的方法
 

　　Caspase活性檢測：
 

　　Caspase蛋白家族的活化是細(xì)胞凋亡的典型特征，其中Caspase-3是凋亡通路下游的關(guān)鍵執(zhí)行分子。
 

　　通過檢測Caspase-3的活性或剪切體的含量，可以反映細(xì)胞凋亡的過程。
 

　　TUNEL檢測：
 

　　TUNEL法(TdT介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法)利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)催化熒光素標(biāo)記的dUTP與斷裂DNA的3'-OH末端結(jié)合，從而檢測DNA斷裂。
 

　　該方法靈敏度高、背景干擾小、毒性低，可定量檢測不同細(xì)胞或組織樣本的凋亡情況。
 

　　四、其他方法
 

　　DNA含量測定：通過熒光染料檢測或細(xì)胞流式分析技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)DNA含量，確定細(xì)胞凋亡程度。
 

　　酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測定：檢測凋亡細(xì)胞裂解后釋放的核小體，以判斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。